本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測兔血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產品包裝破損或質量投拆，請在收到貨一個月之內聯(lián)系我們。

TNF-α簡介：

腫瘤壞死因子（TNF-α）是由單核細胞和巨噬細胞產生的多肽類細胞因子，在炎癥反應、免疫系統(tǒng)的發(fā)展、細胞程序性死亡和脂代謝中起重要的作用。兔TNF-α由35個氨基酸的胞內部，21個氨基酸的穿膜部分，179個氨基酸的胞外部分組成，從ECD部分來說，兔TNF-α與牛，貓，馬，小鼠，豬，大鼠和恒河猴等TNF-α有76%~83%的氨基酸同源性。

TNF-α功能主要是在免疫反應中是一個多功能的調節(jié)器甚至作為一個強烈的熱原性物質刺激中性粒細胞，改變血管內皮細胞的特性，調節(jié)其它組織的代謝活性。TNF-α也可通過抑制脂蛋白脂肪酶的活性而導致惡液病。愛潑斯坦病毒引起的B細胞活化也可被TNF-α所抑制。巨噬細胞表面的淋巴因子和肉毒素也可介導包括上皮細胞、內皮細胞和腫瘤細胞等產生TNF-α。據(jù)報道干擾素能顯著提高TNF-α的分泌量。

TNF-α在關節(jié)炎和其它組織的炎癥的發(fā)病機理中起重要作用。TNF-α也參與了包括哮喘、克羅恩氏病、類風濕性關節(jié)炎、神經性疼痛、肥胖癥、型糖尿病、自身免疫病和腫瘤等疾病的發(fā)生

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中兔TNF-α的濃度。兔TNF-α捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的兔TNF-α會與捕獲抗體結合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗兔TNF-α抗體后，抗兔TNF-α抗體與兔TNF-α接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在TNF-α將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，兔TNF-α濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中TNF-α濃度。

兔TNF-α定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結果將不準確。

注：兔血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶，請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻對保證反應結果的準確性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長。

檢測前準備工作:

1. 試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3. 如有5×標準品稀釋液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4份水)。

4. 標準品:按標簽復溶體積用1X標準品稀釋液復溶使TNF-α終濃度達到2000pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混勻（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為2000pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

5. 

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1不同規(guī)格的加樣槍及相應的槍頭；  

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應孔中，用封板膜封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。對于血清血漿樣本，先加50ul的樣本分析緩沖液，再加50uL樣本。如檢測超出范圍，請先加50ul的樣本分析緩沖液，再加用標準品稀釋液稀釋后的樣本50μl檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)，此處加樣量50ul相當于已稀釋了2倍。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。  

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

兔TNF-α參考標準曲線（向市場部索要）

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結果表明，最小檢出量為28.4pg/ml。

2.特異性：與人TNF-α、大鼠TNF-α、小鼠TNF-α、豬TNF-α等沒有交叉反應。

3.重復性：板內，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻:

1. Schall, T.J. et al. (1990) Cell 61:361.

2. Ito, H. et al. (1986) DNA 5:157.

3. Perez, C. et al. (1990) Cell 63:251.

4. Dembic, Z. et al. (1990) Cytokine 2:231.

5. Moss, M.L. et al. (1997) Nature 385:733.

6. Loetscher, H. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:18324