人髓核細胞永生化

細胞鑒定：免疫熒光鑒定已通過

細胞來源：國內建系

細胞背景：髓核，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，為椎間盤結構的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán) 之間。由縱橫交錯的纖維網(wǎng)狀結構即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質構成的彈性膠凍物質。 發(fā)育成熟的髓核是一個由軟骨樣細胞分散在細胞間質內，周圍圍繞著一個比較致密的膠原纖 維網(wǎng)的含水球，位于椎間盤偏后位置，占推間盤橫斷面積的 50%～60%；由于它的含水量很高， 并和軟骨終板緊密接觸，是椎間盤接受經(jīng)軟骨終板主要營養(yǎng)途徑滲透交換營養(yǎng)的主要部分。 該細胞通過慢病毒轉染的方式攜帶SV40 基因

細胞特性：形態(tài)：成纖維細胞樣，貼壁生長

          用途：僅供科研使用。

培養(yǎng)條件：1） 準備軟骨細胞專用培養(yǎng)體系；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為 70%-80%。

注意事項：

常溫發(fā)貨：收到后 T25 瓶消毒再放置培養(yǎng)箱靜置 2-3 小時后觀察密度和狀態(tài)拍照 2-3 張反饋給 銷售，密度達標就可以傳代。前期傳代比例 1:2，等再次長滿后傳代時建議凍存其中一整瓶成1 個 1ml 凍存管，另外一瓶繼續(xù)傳代，反復凍存 2-3只后才擴增做實驗，以防突發(fā)情況引起斷種。

干冰發(fā)貨：常規(guī)細胞發(fā)貨凍存管 2 只，復蘇 1 只，另外一只備用，第一個復蘇不成功時嚴格 按照廠家要求復蘇第二個，均沒有復蘇成功的情況即時留存復蘇照片通知銷售。

貼壁細胞參考：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞 1-2 次。

2. 加入 0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 于培養(yǎng)瓶中（T25 瓶 1-2mL，T75 瓶 2-3mL）， 置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下 觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入 3-4ml含 10%FBS 的培養(yǎng)基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 3-5min，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。 將細胞懸液按 1：2 的比例分到新T25瓶/6cm 培養(yǎng)皿中，添加 6-8ml 按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按 1:2~1:5 的比例進行。 3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前 3 代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。 4）運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新 配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。

懸浮細胞參考：

懸浮狀態(tài)下生長的細胞，可以通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細胞的生長狀態(tài)，一般情況下細胞密度維持在 1×105~1×106 個/mL（不同細胞對密度要求不同，）可以維持細胞的正 常生長。如需分瓶可以將細胞懸液收集到離心管中 1000rpm，離心5min，棄去上清，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按 1：2 的比例分到新T25 瓶中，添加 6-8ml 按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:4的比例進行。

運輸形式

低溫:1mL 凍存管包裝干冰運輸，收到后-80 度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干

冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

常溫: T25 瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

生物安全

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液

氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。